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"Melatonin enhances the in vitro action of cytochalasin B on globular resistance and osmotic fragility of erythrocytes: a preliminary study"

October 3, 2012 at 10:41


Sul terzo numero del volume 32 (2011) di Neuroendocrinology Letters è stato pubblicato lo studio scientifico dal titolo “Melatonin enhances the in vitro action of cytochalasin B on globular resistance and osmotic fragility of erythrocytes: a preliminary study”, ad opera di Nicola Pacini, Anna Ferrari, Mattia Menozzi e Fabio Borziani. Lo studio è stato condotto presso il Laboratorio Privato di Fisiologia “Prof. Xxxxx Xx Xxxxx” con la collaborazione dell’Associazione Italiana Ammalati Neoplastici "Maria Teresa Rossi".

La N-acetil-5-metossitriptammina o melatonina (MLT), il principale secreto della ghiandola pineale o epifisi, risulta essere inoltre un fattore autocrino-paracrino nei processi immuno-ematopoietici, in considerazione del fatto che tale sostanza è sintetizzata a livello degli organi ematopoietici e linfoidi primari, quali il midollo rosso ematopoietico, il timo, ed in numerose cellule componenti di tale sistema, tra cui i linfociti T, i fagociti mononucleati e le piastrine.

Numerose cellule del sistema immuno-ematopoietico possiedono ed esprimono recettori per la MLT, sia di membrana appartenenti alla famiglia dei recettori accoppiati a proteine G ed in particolare appartenenti al tipo Gi/Gq, che specifici recettori nucleari nei linfociti ed in altre cellule del sistema immuno-ematopoietico, giustificando appieno un’azione di carattere autocrino e paracrino, oltre alla propria azione sistemica ed endocrina correlata con l’oscurità. Oltre a ciò la MLT possiede anche un’attività diretta all’inibizione delle outward currents nei megacariociti ed un’analoga azione nei linfociti dove lega direttamente i canali del potassio VK3.

Alcuni lavori hanno dimostrato che la MLT, pur esercitando un notevole effetto citoprotettivo nei riguardi della perossidazione lipidica della membrana eritrocitaria, in studi fisiologici porterebbe tuttavia ad una diminuzione netta della deformabilità eritrocitaria.

Analizzando tuttavia l’insieme dei dati in letteratura si può ipotizzare come le azioni della MLT sulla deformabilità eritrocitaria e sulla fragilità osmotica siano varie ed eterogenee: in particolare queste azioni risultano essere funzione della dose adottata e degli stati ossidativi dell’emoglobina e della membrana eritrocitaria. Più precisamente, in condizioni di forte stress ossidativo indotto da perossido di cumene e da nitroprussiato sodico la MLT si mostra in grado di offrire una buona protezione dalla perossidazione lipidica, portando ad una diminuzione della formazione di malonildialdeide (MDA) ed a un aumento della deformabilità e della resistenza osmotica. Tali azioni appaiono estrinsecarsi solo a dosi elevate (10 µM - 1 mM) mentre risulta che nel caso in cui sia coinvolta anche l’ossidazione delle proteine, ed in particolare dell’emoglobina, tali azioni di protezione delle membrane permangono ma viene a presentarsi una diminuzione della deformabilità cellulare a causa di un peggioramento dello stato ossidativo a carico del comparto proteico. Nel complesso, la letteratura attuale appare frammentaria ed eterogenea, tanto da non poter esprimere con certezza un reale giudizio sull’eventuale azione della MLT sulla deformabilità eritrocitaria e sulla resistenza globulare.

La citocalasina B (CB) appartiene ad una famiglia di composti derivati dal metabolismo di alcuni gruppi di funghi. Venne isolata per la prima volta nel 1964 quale prodotto metabolico dell’Helminthosporium Dematioideum. Questa sostanza presenta caratteristiche proprietà bioattive, tra cui un’azione antiaggregante piastrinica ed un’attività inibente la citodieresi ed i movimenti cellulari. Sebbene svariati membri della famiglia delle citocalasine inibiscano il trasportatore del glucosio GLUT-1 mediante un sito di legame specifico ad alta affinità sito sulla membrana eritrocitaria, la citocalasina B è un debole inibitore del trasporto di glucosio, il quale viene appunto bloccato in misura minore rispetto alle altre citocalasine.

Al di là delle molteplici attività delle citocalasine, ed in particolare della citocalasina D e della CB, il proprio principale meccanismo d’azione è ascrivibile all’attività che esercitano sullo stato di polimerizzazione della G-actina nei filamenti di F-actina. La CB, con un meccanismo analogo alle capping proteins, blocca la polimerizzazione della G-actina nel filamento di F-actina, legandosi all’estremità barbed ends, destabilizzando i fenomeni di treadmilling e spostando l’equilibrio tra G-actina e F-actina in favore della prima, sebbene taluni lavori abbiano ipotizzato per la CB meccanismi differenti attraverso i quali si attuerebbe la destabilizzazione e la depolimerizzazione dei filamenti di actina. È interessante notare come in condizioni fisiologiche la polimerizzazione dei microfilamenti di actina venga regolata da varie proteine denominate nel complesso actin binding proteins (ABP), tra cui le cosiddette capping proteins, alcune delle quali incappucciando barbed ends bloccano l’aggiunta e/o il distacco di nuove subunità. Altre proteine quali la profillina complessano le subunità di G-actina favorendone l'assemblaggio, mentre la timosina beta complessa la G-actina, impedendone la polimerizzazione in F-actina, ed infine le severin proteins (gelsolina e fragmina), sempre appartenenti alle ABP, tagliano i filamenti di F-actina. L’azione sinergica di queste proteine richiede un innalzamento citoplasmatico di ioni Ca2+, elemento fondamentale nei processi di rimodellamento del citoscheletro.

In vitro la CB riduce fortemente la resistenza osmotica e conduce ad un netto aumento della deformabilità eritrocitaria e dei processi plastici alla base dei cambiamenti della forma eritrocitaria, verosimilmente grazie al legame ad alta affinità della componente actinica del citoscheletro eritrocitario (CSK) e per il blocco dell’azione di GLUT-1. Tali azioni si esercitano molto velocemente nel tempo e risultano reversibili se la CB è rimossa dal medium mediante microdialisi. Sebbene il CSK sia ridotto e morfologicamente differente da quello delle cellule nucleate, presenta microfilamenti sottomembranari del tutto simili a quelli di altre cellule ed è sensibile alla CB.
 

In particolare la struttura del CSK ha un’organizzazione morfologica differente da altri tipi cellulari: anziché una vera e propria rete citoplasmatica tridimensionale, il CSK è composto da una piccola rete proteica sottomembranaria e forma con il plasmalemma un sistema unico che presiede ai complessi ed articolati processi visco-elastici e di deformabilità essenziali per la funzione eritrocitaria. Ciò permette al globulo rosso maturo, la cui vita media è di circa 120 giorni, di muoversi all’interno di vasi il cui diametro può essere nettamente inferiore a quello degli eritrociti stessi.

Negli ultimi 15 anni alcuni lavori hanno indicato nel CSK un possibile target dell’azione della MLT. È inoltre stato dimostrato che la MLT può trovare siti di legame ad alta affinità nei filamenti di F-actina, e verosimilmente anche in quelli di G-Actina. La MLT eserciterebbe altresì un’azione modulatoria sulla Rho-kinase, tale da ridurre la migrazione di cellule cancerose, in particolare della linea MCF-7. Attraverso la modulazione di Rho-kinase estrinsecherebbe parte dei propri meccanismi oncostatici. Appare anche in grado di intervenire nella regolazione del metabolismo idrico influenzando la distribuzione delle acquaporine (trasporto vettoriale di acqua) nell’epitelio isolato di nefroni canini.
 
Considerata perciò l’azione della MLT sul CSK ed in particolare sui microfilamenti actinici e sulla loro dinamica, è risultato interessante valutare se la MLT fosse in grado di influenzare la resistenza osmotica degli eritrociti di ratto, provenienti da sangue intero, preventivamente trattato con CB. Tutto ciò al fine di evidenziare un eventuale rapporto funzionale di agonismo/antagonismo sull’azione svolta da questa sostanza sui microfilamenti actinici. Se la MLT esercitasse perciò un’azione sulla componente actinica del CSK, questa dovrebbe essere evidenziata da modificazioni nella resistenza globulare e nei markers di emolisi.

Nella seguente figura sono riportate le 3 curve di fragilità osmotica.
 

Rispetto alle condizioni fisiologiche (linea colore nero) il trattamento con CB (linea colore grigio scuro) abbassa notevolmente e significativamente la resistenza globulare rispetto al controllo. Il trattamento con CB + MLT (linea grigio chiaro) non modifica l'andamento complessivo della curva di fragilità osmotica riferita alla sola CB, mostrando al contempo un netto aumento del fenomeno emolitico in tutti i punti considerati.

Nella seguente tabella sono riportate le percentuali medie di emolisi dei 10 campioni relativi ai 3 diversi trattamenti. Sono inoltre mostrate le variazioni percentuali riferite ai trattamenti con CB e CB + MLT rispetto ai controlli in 4 dei 9 punti presi in esame.
 

Nella successiva sono riportati i valori di LDH, fosfolipidi totali plasmatici e MDA riferiti ai 10 campioni trattati con CB rispetto ai controlli.



Si può notare come la CB aumenti notevolmente il valore di LDH rispetto ai campioni di controllo: +85% (p<0,0001).



Il livello dei fosfolipidi totali plasmatici permane molto simile e non si mostra nessuna variazione significativa. Il tasso di MDA dopo il trattamento con CB aumenta del 7,9%, valore comunque non statisticamente significativo.
Nella seguente tabella sono riportati i valori di LDH, fosfolipidi totali plasmatici e MDA riferiti ai 10 campioni trattati con CB +MLT rispetto ai campioni trattati con sola CB.
 

Rispetto ai campioni trattati con sola CB i valori di LDH dei campioni trattati con CB + MLT appaiono aumentati del 18,7%.
 

Tale variazione riferita ai primi 8 campioni mostra un aumento del 41,4% con un livello di significatività elevato (p<0,02), mentre rispetto ai controlli i campioni trattati con CB + MLT mostrano un aumento dei valori di LDH del 105% con p<0,0001.

Anche in questa seconda serie di dati il valore dei fosfolipidi totali plasmatici non varia in maniera significativa tra i 2 gruppi. Allo stesso modo i livelli di MDA tra il gruppo trattato con CB + MLT rispetto a quello trattato con sola CB non mostrano significative variazioni, fenomeno verosimilmente legato alle condizioni di reazione fortemente riducenti.

Dai dati sopra riportati è possibile esprimere alcune interessanti considerazioni: così come ben prevedibile la CB abbassa fortemente la resistenza globulare. Tale azione è verosimilmente imputabile ad un notevole aumento dei fenomeni di deformabilità per la perdita della componente actinica del CSK membranario dell’eritrocita, la quale perdita induce appunto un aumento significativo dei fenomeni plastici a carico del globulo rosso. Tutto ciò è ben evidenziabile analizzando la curva di resistenza osmotica globulare che rispetto ai controlli appare fortemente spostata a sinistra. La curva dei campioni trattati con CB  evidenzia un netto aumento dei fenomeni emolitici in tutti i punti presi in esame, fenomeno che si mostra evidente anche dalla diversità nel primo punto di flesso, se confrontato con la curva dei campioni fisiologici. Oltre a ciò è anche evidente come la curva nel suo insieme assuma l’aspetto di una tipica anemia emolitica microcitica, mostrando un andamento tipico delle patologie emolitiche generate per difetti nella struttura ovvero anche nell’espressione e/o nello splicing delle proteine citoscheletriche.

Il trattamento con MLT non contrasta l’azione della CB, ma al contrario la aumenta sia in potenza che in efficacia. La curva della resistenza osmotica globulare dei campioni trattati con CB + MLT appare spostata a sinistra rispetto a quella dei campioni trattati con sola CB: le percentuali di emolisi nei vari punti appaiono costantemente ed uniformemente aumentati. Quest’ultima curva mostra nuovamente il tipico andamento che viene riscontrato nell’anemia emolitica, ovvero nei processi fisiopatologici a carico della componente citoscheletrica della membrana eritrocitaria.

I livelli di LDH sierico, considerati quali marcatori di emolisi, indicano complessivamente un aumento notevole e statisticamente significativo del grado di emolisi nei campioni trattati con CB rispetto ai controlli non trattati. Anche i valori di LDH del gruppo di ratti trattati con CB + MLT rispetto a quelli trattati con sola CB sono statisticamente e significativamente più elevati in 8 campioni su 10. Infine, i campioni riferibili all’azione della CB + MLT mostrano un aumento dei valori di LDH rispetto ai campioni non trattati pari al 105% con p<0,0001. Se il grado di emolisi nei campioni trattati con CB + MLT è effettivamente aumentato dall’esame dei valori di LDH si potrebbe anche concludere che tale effetto, almeno nelle condizioni da noi adottate, non richiede la presenza di ioni Ca2+ che in questi campioni risultavano sequestrati dall’agente chelante.

Rispetto ai controlli, il trattamento con CB aumenta di poco ed in misura non statisticamente significativa i livelli di MDA, che sono generalmente omogenei rispetto a tutti i campioni trattati, verosimilmente a causa delle particolari condizioni riducenti adottate operativamente, e suggerendo che per la manifestazione del meccanismo d’azione della CB non risultano coinvolti fenomeni ossido-riduttivi a carico della membrana lipidica degli eritrociti. Similmente i fenomeni osservati nei campioni trattati con MLT non sembrano imputabili alla propria capacità riducente. I livelli di fosfolipidi sierici appaiono pressoché omogenei in tutti i gruppi trattati suggerendo che non vi siano state rilevanti alterazioni a carico della componente fosfolipidica delle membrane.

Dai dati sopra esposti si può trarre la conclusione che la MLT aumenta in potenza ed efficacia l’azione della CB sui microfilamenti della membrana eritrocitaria. Se da un lato tale fenomeno appare probabile ed evidente, dall’altro è difficoltoso ipotizzare il meccanismo attraverso cui si esprime, così come è arduo stabilire le proprie linee temporali. Tuttavia è possibile avanzare almeno 3 possibili meccanismi mediante i quali la MLT può aumentare l’azione destabilizzante sui microfilamenti esercitata dalla CB. Questa azione potrebbe realizzarsi mediante recettori accoppiati a proteina G ed in particolare attraverso MEL-1, ovvero potrebbe essere la risultante di un’azione della MLT su una delle chinasi associate alla famiglia della Rho-kinase (C), oppure per un’azione sulla calmodulina. È altrettanto verosimile che la MLT possa influire direttamente sui microfilamenti e/o sui monomeri di G-actina, legandosi a questi ultimi. Ciò appare verosimile se si considera che la MLT possiede una piccola struttura molecolare ed al contempo può comportarsi sia come accettore che come donatore di hydrogen bonds, nonché essere responsabile di interazioni π aromatiche. Risulta inoltre interessante notare come la MLT sembri influire sull’attività dell’esochinasi e di altri enzimi coinvolti nella via gli colitica. A tal proposito si ricorda come la G-actina possieda un dominio omologo all’esochinasi, e con grado variabile domini omologhi ad altri enzimi coinvolti nella via glicolitica.

Da ricordare come la G-actina ed i geni che codificano le sue isoforme siano estremamente conservati lungo tutta la scala evolutiva, presentando minime differenze anche tra specie apparentemente diverse e distanti. Tutto ciò suggerisce ed evidenzia per l’actina un’importante relazione evolutiva e filogenetica. Allo stesso modo la MLT è una sostanza ubiquitariamente presente, così come i geni che presiedono all’espressione degli enzimi deputati alla propria sintesi: sono presenti sia nel ragno animale che vegetale, sia in metazoi che in non metazoi, suggerendo ed evidenziando anche per la MLT delle importantissime implicazioni nella filogenesi e nell’evoluzione molecolare e, considerata la propria presenza anche nei non metazoi, un ruolo biologico che va al di là della sola regolazione dei ritmi circadiani. È quindi più che probabile che la MLT, comparsa sulla scena molecolare in tempi estremamente antichi, verosimilmente ben prima dell’evoluzione di altri sistemi molecolari quali quelli recettoriale ed enzimatico, possa interagire con l’actina e con i microfilamenti actinici, con i quali condivide importanti relazioni evolutive e di filogenesi molecolare. Non si può inoltre escludere che alla base dei fenomeni osservati vi sia più di un meccanismo e che questi non siano tra loro mutualmente esclusivi.

Appare più che interessante notare che molte delle azioni della MLT descritte in letteratura potrebbero trovare la propria ragione molecolare in un’azione della stessa sul CSK: ciò appare particolarmente evidente se si considera che il CSK risulta molto importante in vari processi cellulari, tra cui la crescita ed il differenziamento cellulare. Un’azione sul CSK potrebbe altresì essere coinvolta in parte dei propri meccanismi oncostatici e prodifferenzianti.

Per quanto riguarda la propria attività sul sangue e più precisamente sulla componente corpuscolata si possono proporre importanti considerazioni: le proprietà reologiche del sangue sono direttamente correlate al numero di eritrociti ed alla loro forma geometrica. Per ogni mm3 di sangue sono mediamente presenti 3,5-5,5 x 106 eritrociti, 4,5-10 x 103 leucociti e circa 1,5-4 x 105 piastrine. In definitiva per 1.000 eritrociti sono presenti un leucocita e 50-100 piastrine. Queste ultime tuttavia, considerato il proprio esiguo volume sono trascurabili dal punto di vista reologico. Similmente i leucociti possono essere allo stesso modo trascurati in considerazione dell’esiguo numero. Più precisamente l’ematocrito, ovvero la concentrazione volumetrica della frazione corpuscolata del sangue, può essere assimilabile alla frazione volumetrica dei globuli rossi. Da un punto di vista reologico, mentre il plasma può essere considerato un fluido con comportamento newtoniano, il sangue intero non è assimilabile ad un fluido newtoniano e presenta un comportamento pseudoplastico. In definitiva la viscosità totale del sangue intero è la somma tra la viscosità degli eritrociti e la viscosità del plasma. Considerando infine che la viscosità del plasma è assimilabile ad una costante compresa tra 1,2-1,9 cP, si comprende come la viscosità del sangue sia in definitiva funzione della viscosità degli eritrociti in relazione a tre fondamentali variabili: la frazione volumetrica dei globuli rossi o ematocrito, la formazione di rouleaux e la deformabilità eritrocitaria.

Le considerazioni sopra esposte hanno tuttavia una valenza per lo scorrimento del sangue in vasi di piccolo diametro ed in particolare nelle metarteriole, nei capillari con diametro anche di soli 3 µm e nelle piccole venule e vasi di piccolo-medio calibro, mentre in vasi di grandi dimensioni, come ad esempio l’aorta, il comportamento del sangue è in realtà non più pseudoplastico ma newtoniano. È comprensibile perciò quanto siano fondamentali le relazioni fra viscosità del sangue ed efficienza del microcircolo. La viscosità del sangue aumenta fortemente con il diminuire della deformabilità: questa caratteristica dei globuli rossi è estremamente importante e trova origine dalle proprietà del sistema membrana-CSK degli eritrociti, dalle caratteristiche della viscosità del liquido interno e dal rapporto tra volume/area superficiale.

Se si considera che la CB, attraverso la propria potente azione destabilizzante sui microfilamenti, aumenta abnormemente la deformabilità eritrocitaria fino a ridurre fortemente la sua fragilità osmotica, che la MLT in condizioni di basso stress ossidativo è capace di aumentare in potenza ed efficacia l’effetto della CB, e se si analizza l’insieme delle considerazioni sopra riportate, un  intervento della MLT sul CSK eritrocitario ed in particolare sui microfilamenti actinici appare ragionevolmente ipotizzabile.

Poiché infine la MLT è sintetizzata e/o accumulata nelle piastrine, ed in vitro gli eritrociti stessi sono capaci di convertire la serotonina in MLT, che molte altre cellule del sistema immuno-ematologico ed immuno-ematopoietico sono capaci di sintetizzarla quale fattore autocrino-paracrino anche indipendentemente dal fotoperiodo, non si può affatto escludere un proprio importante ruolo nella fisiologia del microcircolo dove potrebbe attivamente concorrere alla complessa regolazione della viscosità del sangue attraverso una modulazione dei fenomeni di plasticità eritrocitaria. In tal senso alcuni lavori presenti in letteratura ci sembrano offrire interessanti spunti di riflessione.

Dai dati e dalle considerazioni sopra riportate si può concludere che nelle condizioni seguite la MLT aumenta in potenza ed efficacia l’azione sui globuli rossi della CB, verosimilmente attraverso un’azione sui microfilamenti actinici e sul CSK. Questi potrebbero rappresentare un nuovo target d’azione della MLT. Ulteriori e più strutturati studi saranno necessari per comprendere appieno i fenomeni espressi in precedenza. Appare tuttavia possibile come mediante queste proprie plausibili azioni la MLT possa giocare un ruolo attivo nel controllo delle proprietà reologiche e nella meccanica di scorrimento del sangue così come nella modulazione dei fenomeni plastici a carico dell’eritrocita.

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