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"Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells: Action as a pro-drug to deliver hydrogen peroxide to tissues"

September 17, 2012 at 22:35


Sul numero del 20 Settembre 2005 del Proceedings of the National Academy of Sciences è stato pubblicato lo studio scientifico dal titolo “Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells: Action as a pro-drug to deliver hydrogen peroxide to tissues”, ad opera di Qi Chen, Michael Graham Espey, Murali C. Krishna, James B. Mitchell, Christopher P. Corpe, Garry R. Buettner, Emily Shacter e Mark Levine.

Fin dai tempi dell'articolo di Pauling e Cameron pubblicato nel 1976 si è a conoscenza che elevate dosi di acido ascorbico sono in grado di prolungare notevolmente la sopravvivenza di malati di cancro in stadio terminale non più suscettibili di trattamento (Cameron & Pauling, 1976). Tale azione fu posta in relazione al possibile contrasto dell’acido ascorbico nei confronti della ialuronidasi con un conseguente rallentamento del processo di metastatizzazione. Uno studio successivo eseguito presso la clinica Mayo non mostrò i medesimi risultati (Creagan et al., 1979). Ciò provocò forti critiche al lavoro di Pauling e Cameron, nonostante in quest’ultima ricerca l’acido ascorbico fu somministrato unicamente per via orale e non per via endovenosa. Successivi studi e case report evidenziarono come l’acido ascorbico risulti attivo unicamente a determinate ed elevate concentrazioni: vari autori hanno compiuto studi di farmacocinetica dimostrando che solo concentrazioni ematiche superiori a 20 mM risultano attive nei confronti delle neoplasie.

Da più parti si scatenarono pressanti critiche a proposito di eventuali controindicazioni relative all’utilizzo di megadosi di acido ascorbico. Tuttavia, si trattò di allarmismi ingiustificati in quanto sia elevate dosi per via orale, con quantità anche superiori a 10 grammi al giorno, così come dosi addirittura maggiori somministrate per via endovenosa non evidenziano effetti tossici (Hoffer et al., 2008; Padayatty et al., 2010). Come già rilevato dal vitaminologo Alberto Fidanza e da vari autori in tutto il mondo, compresa una retrospettiva clinica su migliaia di pazienti affetti da cancro terminale, gli effetti collaterali dell’utilizzo di acido ascorbico in grandi quantità sono modesti: tra questi, il rischio di una calcolosi ossalica per chi si sottopone a terapia endovenosa è appena superiore dell’1% rispetto alla popolazione normale.

Nel 2005, al tempo in cui venne pubblicato questo studio di Chen et al., varie ricerche avevano evidenziato per l’acido ascorbico in vitro un’azione oncostatica ed inducente alla morte cellulare. Tuttavia, i meccanismi biomolecolari di questa attività non erano ancora stati pienamente compresi.

All’interno di questa pagina riportiamo alcuni estratti virgolettati tradotti dall’articolo di Chen et al. supportati da nostri commenti.


«Dati di farmacocinetica indicano che concentrazioni farmacologiche di acido ascorbico (ascorbato) nel sangue potrebbero possedere un ruolo peculiare nel trattamento del cancro. I nostri obiettivi sono stati quelli di verificare se l'ascorbato è in grado di uccidere le cellule cancerose in modo selettivo, ed in caso affermativo, di determinarne i meccanismi. La morte cellulare in 9 tipi di cellule tumorali ed in 4 tipi di cellule normali è stata misurata successivamente all’esposizione della durata di un’ora a soluzioni di ascorbato. Le cellule normali non sono state influenzate dall’ascorbato alla concentrazione di 20 mM, mentre 5 linee tumorali hanno mostrato valori di EC50 <4 mM, una concentrazione facilmente raggiungibile con somministrazione endovenosa.»

«Cellule di linfoma umano sono state studiate in dettaglio grazie alla loro sensibilità all'ascorbato (EC50 di 0,5 mM) ed alla propria idoneità a verificarne i meccanismi. L’ascorbato extracellulare, ma non quello intracellulare, ha mediato la morte cellulare, la quale si è verificata per apoptosi e per picnosi-necrosi. La morte cellulare si è mostrata indipendente da chelanti metallici ed assolutamente dipendente dalla formazione di perossido di idrogeno (acqua ossigenata, H2O2). La morte cellulare ottenuta con l’aggiunta di H2O2 alle cellule è risultata identica a quella rilevata quando il H2O2 è stata generato dal trattamento con ascorbato. La generazione di H2O2 è dipendente dalla concentrazione dell’ascorbato, dal tempo di incubazione e dalla presenza di 0,5-10% di siero, mostrando una relazione lineare con la formazione di radicale ascorbile.»

«Sebbene l’aggiunta di ascorbato al mezzo abbia generato H2O2, l’aggiunta di ascorbato al sangue non genera livelli rilevabili di H2O2 e solo tracce appena misurabili di radicale ascorbile. Considerati insieme, questi dati indicano che l'ascorbato a concentrazioni raggiungibili solamente mediante somministrazione endovenosa può comportarsi da profarmaco per la formazione di H2O2, e che il sangue può fungere da sistema di rilascio del profarmaco ai tessuti. Questi risultati consegnano plausibilità all’uso endovenoso di ascorbato nel trattamento del cancro, e mostrano inaspettate implicazioni nel trattamento delle infezioni in cui il H2O2 può risultare di beneficio.»

Il presente studio ha posto in evidenza gli effetti dell’ascorbato su 10 linee tumorali umane e su 4 linee cellulari normali. Altresì, questa ricerca ha proposto la risoluzione ad essenziali interrogativi all’epoca ancora senza risposta:

--- l’azione dell’acido ascorbico si presenta a livello intra- od extracellulare?
--- a quali dosaggi si manifestano questi effetti?
--- quali meccanismi sono implicati in questa azione?

Per cercare di consegnare una risposta a queste fondamentali domande, come già detto, in questo lavoro si è valutato l’effetto di dosi farmacologiche di ascorbato sulla EC50, ovvero sulla dose in grado di uccidere il 50% della popolazione cellulare esaminata.

«In primo luogo abbiamo valutato se l'ascorbato a concentrazioni farmacologiche sia in grado di  intervenire selettivamente sulla sopravvivenza delle cellule tumorali, studiando 9 linee cellulari e 4 tipi di cellule normali. Le analisi di farmacocinetica clinica dimostrano che concentrazioni farmacologiche di ascorbato nel plasma, da 0,3 a 15 mM, sono raggiungibili unicamente con somministrazione endovenosa.»

«Queste alte concentrazioni sono eliminate in poche ore per filtrazione renale ed escrezione. Al contrario, le concentrazioni plasmatiche di ascorbato raggiungibili con le massime dosi di acido ascorbico assunto per bocca non possono superare i 0,22 mM, a causa del limitato assorbimento intestinale. Per simulare il potenziale uso clinico endovenoso, le cellule testate sono state incubate per un’ora sia con concentrazioni farmacologiche di ascorbato (0,3-20 mM) che di un'alta concentrazione fisiologica (0,1 mM) come controllo.»

«Una volta che l’ascorbato è stato rimosso, la sopravvivenza delle cellule è stata determinata dopo 24 ore con la tecnica del nuclear staining o MTT. Per 5 delle 9 linee cellulari tumorali le concentrazioni di ascorbato in grado di causare una diminuzione del 50% della sopravvivenza cellulare (EC50) erano inferiori a 5 mM, una concentrazione facilmente raggiungibile con infusioni endovenose. Tutte le cellule normali testate sono risultate insensibili a concentrazioni 20 mM di ascorbato.»
 
 
 
Come si può vedere dal grafico sopra riportato, nella sezione A è espressa la EC50 per le varie linee tumorali. Molto interessante è il fatto che le 4 linee cellulari normali non abbiano risentito di alcun effetto relativo alla somministrazione di ascorbato. Da ciò e dai buoni dati di sicurezza clinica deriva che per quanto riguarda l’utilizzo di ascorbato si può parlare di tossicità selettiva.

Nella sezione B è mostrata la capacità di formare colonie di cellule pretrattate per un’ora con una dose di ascorbato alla concentrazione di 5 mM. È da notare come normalmente le concentrazioni fisiologiche di ascorbato siano nell’ordine 0,2-0,3 mM. Tutte le cellule di questa serie di esperimenti sono state incubate per un’ora e la valutazione biochimico-morfologica dell’azione dell’ascorbato è stata effettuata 24 ore dopo, a seguito dell’eliminazione per microdialisi dell’ascorbato dal mezzo di coltura.

Altro risultato interessante è stato evidenziato mediante curve dose/risposta, le quali hanno tenuto conto della morfologia e del processo biochimico-funzionale della morte cellulare. In questa serie di esperimenti sono state utilizzate cellule umane di linfoma di Burkitt e la loro controparte di linfociti sani.
 
 
 
Come si può evincere dalla figura, è presente una stretta dose/dipendenza tra concentrazione di ascorbato e morte cellulare (sezioni C e D), mentre il meccanismo e la morfologia della morte cellulare, e l’intensità del processo, sono evidenziati nei riquadri A e B. Da ciò si può considerare come successivamente all’esposizione per un’ora all’ascorbato si inneschino dopo circa 6 ore una serie di processi apoptotici, seguiti da picnosi, mentre successivamente la maggioranza delle cellule muore per necrosi.

Altro importante punto di ricerca di questo interessante studio è stato quello di evidenziare il principale meccanismo mediante il quale l’ascorbato di sodio (maggiore densità elettronica sul sistema gem-dienoico-coniugato ad un carbonio sp2) manifesta gli effetti sopra riportati mediante la generazione e la formazione di H2O2 (per una rassegna dettagliata sui radicali liberi, la loro struttura ed il proprio ruolo biologico si rimanda all’apposita pagina nella sezione strutture, dove è descritto anche il ruolo delle specie reattive dell’ossigeno nelle neoplasie). Così come è stato evidenziato, l’azione dell’ascorbato si esprime mediante la formazione di H2O2, e che tale fenomeno si realizza a livello extracellulare, in quanto il precarico intracellulare di linfociti neoplastici non manifesta alcun effetto.

Nella sezione A della seguente figura si evidenzia che gli effetti sulla morte delle cellulare di linfoma di Burkitt con ascorbato alla concentrazione di 2 mM sono revertiti da vari antiossidanti e dall’enzima catalasi, l’antagonista fisiologico del H2O2.
 
 
 
Nella sezione B si mostra inoltre che l’azione dell’ascorbato è proporzionale alla generazione di H2O2. I medesimi concetti sono ottimamente espressi dalle curve dose/risposta nelle sezioni C e D. Da notare come sia i monociti che i linfociti normali subiscano poco o nulla l’azione dell’ascorbato, ovvero del H2O2, che può a ragion veduta essere considerato il vero farmaco, in quanto l’ascorbato può, almeno in relazione a questo meccanismo, venire considerato a tutti gli effetti come un profarmaco. Altra cosa interessante riguardante la sezione A è che la chelazione di metalli di transizione non inibisce la formazione di H2O2, suggerendo che metalli quali il rame, il ferro, il manganese non interferiscono né svolgono ruoli determinanti nel catalizzare la reazione che conduce alla formazione del H2O2. Tuttavia, oggi detta visione è stata in parte ridimensionata...

«Come specifico test d’azione dell’ascorbato, la quantità di H2O2 formato in presenza di ascorbato è stata misurata usando un elettrodo di ossigeno. Abbiamo confrontato gli effetti sulla morte cellulare delle diverse quantità di H2O2 formatesi in presenza di ascorbato rispetto agli effetti del H2O2 aggiunto dall’esterno. Il H2O2 generato dall’ossidazione dell’ascorbato ed il H2O2 aggiunto dall’esterno hanno prodotto curve di morte cellulare tra loro indistinguibili.»

«La sensibilità all’esposizione diretta al H2O2 è stata maggiore in cellule di linfoma rispetto ai linfociti normali ed ai monociti normali, in linea con il modello di citotossicità trovato precedentemente con l'esposizione all’ascorbato a concentrazioni farmacologiche. Considerati insieme, questi dati sono coerenti con la conclusione che l'ascorbato extracellulare induce morte cellulare causata dalla formazione di H2O2.»

«I nostri dati mostrano come l'acido ascorbico colpisca selettivamente le cellule cancerose, ma non quelle normali, a concentrazioni che possono che essere raggiunte esclusivamente con somministrazioni endovenose ed in condizioni che riflettono il potenziale uso clinico. L'effetto è dovuto unicamente all’ascorbato extracellulare e non a quello intracellulare. La morte cellulare mediata dall’ascorbato è dovuta alla generazione extracellulare di H2O2, tramite la formazione di radicale ascorbile con l’ascorbato quale donatore di elettroni. Come il glucosio, quando l'ascorbato è somministrato per via endovenosa, le concentrazioni farmacologiche risultanti dovrebbero distribuirsi rapidamente negli spazi extracellulari. Abbiamo dimostrato che tali concentrazioni farmacologiche di ascorbato nel mezzo generano radicale ascorbile e H2O2. In contrasto, le stesse concentrazioni farmacologiche di ascorbato nel sangue generano una quantità di radicale ascorbile appena rilevabile e una quantità di H2O2 non misurabile. Questi risultati possono essere relativi alle efficaci vie cataboliche riguardanti il H2O2 nel sangue (ad esempio, catalasi e glutatione perossidasi) rispetto a quelle nel mezzo o nel liquido extracellulare. La totalità dei dati è coerente con l'interpretazione che l'acido ascorbico somministrato per via endovenosa a concentrazioni farmacologiche può comportarsi da profarmaco per il rilascio di H2O2nel mezzo extracellulare, senza accumulo di H2O2 nel sangue.»

L’acido ascorbico è fisiologicamente deputato alla sintesi del collagene: nel tessuto connettivo agisce proprio a livello dei liquidi extracellulari. Da questo studio è emerso una forte attività catalitica del mezzo extracellulare: questa potrebbe essere ascrivibile a reazioni di ossidoriduzione tra l’ascorbato e proteine, quali albumine e globuline, con peso molecolare di 10-30 kDa. Come riportato dagli autori dello studio, l’antagonismo operato dal sangue potrebbe riguardare l’attività riducente espressa dai globuli rossi, i quali sono ricchi di sistemi antiossidanti (catalasi, superossido dismutasi, glutatione per ossidasi, ecc.), il tutto retto dall’attività della glucosio-6-fosfatodeidrogenasi (G6PDH) e dalla via dei pentoso fosfati. Secondo il presente studio resta da chiarire la particolare e curiosa espressione della selettiva tossicità dell’ascorbato per le cellule cancerose rispetto a quelle sane…

«È sconosciuto il perché l'ascorbato, tramite il H2O2, sia in grado di uccidere le cellule tumorali, ma non quelle normali. Non è presente alcuna correlazione tra la morte cellulare indotta dall’ascorbato ed il glutatione, l’attività della catalasi, o l'attività della glutatione perossidasi. Questi dati mostrano che l’ascorbato dirige la sintesi di H2O2 negli spazi extracellulari, ma i target del H2O2 potrebbero essere sia intracellulari che extracellulari, in quanto il H2O2 può attraversare le membrane. Ad esempio, il H2O2 extracellulare potrebbe interessare i lipidi di membrana, con la formazione di idroperossidi o intermedi reattivi che possono venire eliminati in cellule normali ma non in cellule tumorali sensibili. Nelle cellule tumorali il H2O2 intracellulare potrebbe avere come bersaglio il DNA, le proteine di riparazione del DNA o i mitocondri, a causa della diminuita attività della superossido dismutasi.»

La chiave di volta per i fenomeni descritti precedentemente potrebbe ricercarsi nell’effetto Warburg, ovvero nel particolare assetto metabolico delle cellule neoplastiche. È stato recentemente dimostrato che l’insieme di enzimi NOX (complessi multimerici delle membrane cellulari) con attività NADPH/NADH ossidasica, svolgono un ruolo di primaria importanza nella genesi dell’effetto Warburg e nel suo mantenimento (Lu et al., 2012). Grazie alla propria attività ossidasica liberano NADPH/NADH ridotto, rendendoli disponibili al mantenimento dell’alto flusso glicolitico. L’attività NADPH/NADH ossidasica di NOX richiede d’altronde una notevole sintesi ex-novo di NADPH in modo tale da contrastare lo stress ossidativo, in quanto questa classe di enzimi produce come sottoprodotto H2O2. Da ciò deriva che una cellula neoplastica è soggetta all’attacco di radicali liberi ed a stress ossidativo, e parallelamente produce grandi quantità di piruvato e lattato nell’interstizio, i quali presentano una propria attività riducente. Oltre a ciò è stato anche notato come spesso le cellule neoplastiche siano carenti di catalasi. Inoltre, l’enzima G6PDH è essenziale per la sopravvivenza delle cellule tumorali, in quanto contribuisce in modo essenziale a generare NADPH, cofattore essenziale per l’attività glutatione perossidasica, in grado di proteggere cellule già sottoposte a notevole stress ossidativo a causa della propria peculiare condizione metabolica. L’inibizione della G6PDH si è rivelata capace di incidere notevolmente sulla sopravvivenza di cellule tumorali e di abbattere notevolmente la loro vitalità (Jiang et al., 2011).

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