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Associazione Bioprogress Onlus

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L’impegno che intende affrontare l’Associazione Bioprogress Onlus è quello di studiare, approfondire e promuovere le potenzialità delle Terapie Biologiche.

È opportuno cercare di definire il concetto stesso di terapie biologiche e tentare di tracciarne i confini. Tuttavia, è difficile riuscire a comprendere le terapie biologiche ed il vasto universo della chimica biologica ad esse connesso in una definizione precisa. Volendo comunque definire e disegnare un nucleo portante di ciò che per noi sono le terapie biologiche si può iniziare a considerare la vastità dell’esistenza dei viventi, l’origine stessa della vita ed il suo continuo divenire come retti e sostenuti dal costante succedersi di reazioni chimico-fisiche sotto il controllo della termodinamica e delle leggi che governano la materia. Così, attraverso la chimica-fisica, la Biologia, ovvero sia la Scienza della vita e dei viventi, cerca, sia pure con approssimazioni e con inevitabili compromessi, di descrivere la realtà della vita in termini molecolari, cellulari ed anatomo-funzionali. Da questa visione unitaria è possibile acquisire le basi epistemologiche e semantiche atte alla comprensione dei fenomeni vitali e della loro prorompente maestosità e naturale bellezza.

Da ciò si può giungere a modificare quello che il fisiologo francese Claude Bernard definì ambiente interno, in cui ogni cellula, ogni organo, ogni individuo risultano dominati da leggi e regole definite.

In questo modo, se alla fine del XIX secolo Bernard definì il concetto di omeostasi, oggi i progressi e le acquisizioni della chimica biologica e della biofisica permettono non solo una descrizione passiva ed ammirata della realtà biologica, ma consentono inoltre di poterla modificare intervenendo su di essa. Ciò, che coincide con il precipuo compito del medico, non si esprime in un atto passivo ed empirico guidato dalla limitata esperienza gnoseologica, ma grazie ai progressi della scienza della vita può divenire un impegno attivo e consapevole.

Premesso questo, si può quindi tentare di disegnare la Medicina Biologica come quella pratica che utilizza molecole quali vitamine, ormoni, autoacoidi, neurotrasmettitori, ecc. o di analoghi, interagenti con il mondo dei viventi poiché appartenenti agli ordinari processi biochimico-fisiologici della vita, al fine ultimo di ripristinare, correggere ed integrare funzioni fisiologiche alterate da processi fisiopatologici o da modificazioni e perturbazioni dell’equilibrio biochimico. Tutto ciò non è unicamente rivolto ad un esercizio strettamente terapeutico quanto anche a migliorare la qualità della vita intesa come un processo integrato mente-corpo, ovvero riprendendo la definizione di salute espressa dall’OMS, non si tratta di perseguire la salute intesa come assenza di malattia, quanto promuovere la realizzazione del benessere psico-fisico dell’uomo.

A seguito di queste premesse è importante esprimere un punto essenziale della nostra visione: non esiste e non è altresì concepibile il ritenere la medicina biologica in contrapposizione alla medicina convenzionale, ovvero non esistono e non hanno ragione di esistere due medicine contrapposte. La medicina, che nella notte dei tempi traeva le proprie origini nella ritualità e nell’arte dei segni, nasceva come empirico e rudimentale sforzo dell’uomo per sfuggire alla caducità ed al dolore insito nella vita stessa. Si può e si deve quindi concludere che le terapie biologiche non sono e non possono essere considerate medicine alternative in contrapposizione alle regole della medicina convenzionale, ma una parte attiva integrante del tessuto medico-biologico.

La medicina biologica è quindi la medicina conosciuta e vissuta attraverso l’esperienza e gli interventi metodologici della biologia, la quale in ultima istanza trova nella chimica e nella fisica l’esperienza gnoseologica su cui erge il proprio fondamento. È perciò ovvio che esperienze spesso immerse nell’antica matrice ancestrale della medicina, quando questa era arte sciamanica, non possono trovare posto alcuno al proprio interno. Ciò non è certo per dogmatismo, né tanto meno per presunzione, ma la scienza della vita trova il proprio fondamento nel poderoso approccio derivato dal metodo scientifico, ovvero nella forza della misura e della corretta interpretazione dell’insieme di dati. Da ciò deriva che il vasto insieme di pratiche quali bioenergetica, omeopatia, ecc., che altro non rappresentano se non il retaggio storico-culturale del passato, non rientrano in detti canoni, i cui confini sono disegnati dai limiti del metodo scientifico. Con ciò non si vogliono presentare giudizi, ma solo precisare un capitale concetto di fondo.

Spesso i detrattori della medicina biologica nulla sanno di ciò che criticano, né viene compiuto alcun sforzo gnoseologico per provare o confutare le varie tesi. Troppo frequentemente si assiste alla passiva accettazione delle correnti opinioni, ovverosia troppi biologi, farmacisti, medici, sono vittime di preconcetti senza conoscere ciò che stigmatizzano o semplicemente giudicano, spesso pur non conoscendo la differenza tra un’ammina ed un’ammide, fra una vitamina ed un autoacoide, o nulla conoscendo della letteratura a proposito dei progressi della vitaminologia, demandando e risolvendo il tutto a semplici nozioni dei tempi dell’università.

Esistono molti assiomi duri a morire, frutto di vecchie ed arcaiche concezioni, cadute sotto l’avanzare del progresso biochimico: tra questi l’idea che le vitamine siano sostanze atte a far crescere un tumore, mentre alcuni rudimentali ma indicativi studi hanno confermato l’utilità di numerose sostanze biologiche in pazienti affetti da diverse forme neoplastiche. Altro assioma discutibile è quello legato alla dose giornaliera raccomandata (Recommended Daily Allowance: RDA).

 

Una vitamina viene definita come un cofattore essenziale al manifestarsi di reazioni biologiche: da ciò la presenza di tipiche malattie da carenza, quali il beri-beri per la vitamina B1, la pellagra per la vitamina B3, lo scorbuto per la vitamina C e così via. Oggi, nelle moderne civiltà occidentali, i quadri clinici delle vecchie malattie da carenza appaiono virtualmente assenti o scomparsi, tuttavia tra patologia conclamata e vari e più fini stati carenziali esiste una notevole differenza ed una gamma intermedia di condizioni. Questo è anche in relazione alle abitudini ed agli stili di vita dello sviluppo occidentale: ad esempio, donne in trattamento con anticoncezionali orali richiedono dosi maggiori di vitamina C, così come si mostrano necessità differenti di assunzione di vitamine nelle varie età e nei vari stati fisiologici e/o fisiopatologici.

Purtroppo, da parte di numerosi studiosi, seppur riconosciuti molto preparati in questi argomenti, si assiste ad una continua ed incessante dogmatica “lotta contro”: una qualsiasi integrazione che non rispecchi i limiti della RDA viene avversata, così come ancora oggi è possibile leggere nei testi per studenti delle discipline mediche e biologiche che l’assunzione di vitamine a dosaggi superiori alla RDA non solo è pericolosa ma può causare morte in chi ne fa largo uso. Contrariamente a ciò, nella letteratura medica, salvo specifiche eccezioni, non sono riportati casi evidenti ed inconfutabili di effetti tossici nell’utilizzo di grandi dosi di vitamine.

Con questo non si vuole affatto lanciare un invito ad usare indiscriminatamente megadosi di vitamine, antiossidanti, flavonoidi, ecc. ma solo esprimere come a volte le informazioni a cui si può ottenere accesso risultino sostanzialmente scorrette. Altresì, a dosi farmacologiche, le stesse vitamine divengono veri e propri presidi medici, da utilizzarsi appunto sotto la guida del medico in un processo terapeutico di pari dignità rispetto a qualsiasi altra terapia.

Quanto e come può intervenire la medicina biologica sulle più disparate condizioni patologiche dell’uomo?

Per tentare almeno parzialmente di rispondere a questa fondamentale domanda occorre farsi illuminare dall’esperienza certa e dal più ferreo e logico razionalismo. Si consideri ad esempio uno dei massimi problemi capitali che interessa ed affligge l’umanità fin dalla notte dei tempi: il cancro, o meglio, le malattie neoplastiche. Nessun aspetto della patologia umana suscita più riverenza e timore… Sebbene gli sviluppi delle tecniche chirurgiche abbiano compiuto notevoli progressi, ancora oggi troppo spesso si soffre, si muore e si soccombe sotto il peso delle patologie oncologiche. Questa non è una critica alla medicina “convenzionale” ed ai propri mezzi terapeutici, ma solo un primo punto di riflessione su cui poggiare il seguito del nostro approccio logico-procedurale. Similmente, accanto ai vari percorsi di terapie convenzionali, sono sorti e sorgono periodicamente percorsi alternativi ed approcci di ogni genere per cercare di contrastare l’immenso problema cancro: si fa riferimento, ad esempio, ad improponibili cure con le più disparate sostanze (veleni, bicarbonati, psicoterapie, ecc.), il tutto intriso di personaggi troppo spesso animati da ignoranza, pressapochismo e sciagurati istinti...

L’argomento cancro rappresenta ancor oggi una grande sfida ed un immenso terreno di ricerca che sfiora i molteplici aspetti della scienza biomedica, dalla biologia molecolare alla fisiologia, fino alla clinica ed alle scienze del farmaco, per giungere quasi a sconfinare nella filosofia della scienza: si rifletta, ad esempio, alla disputa quasi filosofica sull’origine staminale o clonale del cancro.

Sebbene ogni cellula possieda caratteristiche strutturali comuni (nucleo, membrana cellulare, organuli citoplasmatici, ecc.), presenta inoltre peculiari specializzazioni che la rendono capace di sopperire a determinate necessità funzionali. Il processo di specializzazione funzionale e morfologica è complessivamente denominato differenziazione cellulare.

Ogni cellula del nostro organismo discende dallo zigote, ovvero dalla fusione dei due gameti: la cellula uovo e lo spermatozoo, due cellule germinali con patrimonio genetico aploide. Da questa cellula origina la blastocisti.

 

Dalla blastocisti originano i tre foglietti embrionali, da cui per successive divisioni e grazie alla differenziazione cellulare viene a generarsi lo sviluppo embrionale prima e del feto successivamente.

 

Questo complesso ed articolato processo prende il via da cellule staminali totipotenti, capaci di dar vita all’intero organismo e di originare i circa 250 citotipi specializzati di un individuo. Le stesse cellule staminali possono presentare un certo grado di differenziazione: esistono cellule staminali totipotenti totalmente indifferenziate, capaci appunto di generare un intero individuo, cellule staminali pluripotenti, in grado di originare una qualsiasi delle tre principali linee germinative: endoderma, mesoderma ed ectoderma. Si conoscono poi cellule staminali multipotenti, capaci di sviluppare un numero limitato di citotipi specifici, cellule oligopotenti, che possono generare solo poche linee cellulari, ed infine unipotenti, che originano un solo citotipo, così da permettere il rinnovamento tissutale.

Uno dei processi indubbiamente più complessi e affascinanti della vita è rappresentato dall’intricata rete di fenomeni che governa il differenziamento cellulare. Tutte le cellule, comprese le cellule staminali, possiedono al proprio interno l’intero patrimonio genetico, ovvero l’informazione necessaria alla trascrizione ed alla traduzione di ogni proteina. Pertanto, cosa rende una cellula muscolare in grado di  esprimere le proteine tipiche del sarcomero, anziché le proteine specifiche di un neurone? All’origine di questo articolato fenomeno intervengono due complessi meccanismi fondamentali: l’azione locale di specifici fattori di crescita e trofici, e la lettura differenziale del codice genetico.

Questa lettura differenziale è resa possibile grazie a modificazioni di carattere epigenetico. Come è noto, il DNA o acido desossiribonucleico, è composto da una serie di polimeri acidi (contenenti gruppi fosfato, carichi negativamente) strettamente associati a proteine basiche (cariche positivamente) dette istoni, con le quali dà origine ad un’elaborata struttura, condensandosi in livelli di organizzazione crescente.

 

Le proteine ricche di gruppi basici (-NH2), protonati a pH fisiologico (-NH3+) sviluppano salde interazioni ioniche con i gruppi fosfato carichi negativamente, nonostante questi gruppi basici possano venire acetilati, formando un legame ammidico così da perdere detta carica positiva. L’insieme del DNA e delle proteine ad esso associate si definisce cromatina. I vecchi istologi erano soliti distinguere fra eucromatina ed eterocromatina, ovvero fra cromatina condensata e cromatina a minor grado di condensazione. Un segmento di DNA che codifica per una proteina (gene), legato agli istoni è assimilabile ad un libro che posto in uno scaffale chiuso a chiave non può essere letto. I meccanismi che guidano la condensazione, ovverosia la deacetilazione degli istoni, sono estremamente complessi e coinvolgono la metilazione dei residui di citosina nella posizione 5’.

 

In sintesi, detti complessi meccanismi di regolazione dell’accesso all’informazione genetica costituiscono la base molecolare dell’espressione genica differenziale. I cambiamenti ed il rimodellamento della cromatina a propria volta sono determinati dalla risultante di complesse interazioni e fenomeni di competizione tra ormoni, fattori di crescita e vari autoacoidi, i quali agiscono in modo endocrino, paracrino ed autocrino.

In un organismo differenziato adulto si mostra un continuo ricambio o turnover cellulare: ad esempio, le cellule dell’epitelio di rivestimento dell’apparato digerente vengono rimpiazzate ogni 48-72 ore, così come i globuli rossi, nel numero di 30 miliardi al giorno. Appare perciò un continuo equilibrio tra cellule che muoiono attraverso il fisiologico e naturale processo dell’apoptosi, chiamato anche morte cellulare programmata, e cellule che vengono rimpiazzate, sebbene esistano anche tessuti cosiddetti perenni, che in caso di alterazione non possono venire sostituiti. Fin dal XIX secolo, i tessuti furono classificati in labili, stabili e perenni. Tuttavia, oggi è ormai universalmente accettato che esistono comparti di cellule staminali anche in tessuti perenni: ad esempio, è stata dimostrata e ben documentata la neurogenesi ippocampale.

Da anni sono state documentate e ben studiate sottopopolazioni di cellule staminali nei tumori umani ed animali. Secondo un modello oggi universalmente noto ed accettato, i tumori, siano essi di origine epiteliale (carcinomi) o di origine mesodermica (sarcomi), così come le forme miste, originano a causa di una serie di mutazioni, le quali portano alla selezione di uno specifico clone che dà origine alla neoplasia. Ad esempio, nel mieloma multiplo si dimostra la generazione di anticorpi identici, originati cioè da un solo clone. Più precisamente, secondo questo modello, una neoplasia si sviluppa da una cellula somatica che ha acquisito mutazioni ed alterazioni nel proprio patrimonio genetico, ed attraverso un complesso processo si è successivamente trasformata acquisendo un fenotipo neoplastico. In un organismo adulto sono presenti numerose cellule trasformate, che non necessariamente sviluppano una neoplasia conclamata clinicamente. Ciò è stato evidenziato in numerosi reperti autoptici di soggetti deceduti in età avanzata, a causa di incidenti o per altre patologie, nei quali sono stati frequentemente riscontrati tumori in situ senza manifestazioni cliniche.

Non una ma una serie di mutazioni sarebbero necessarie affinché una cellula sana subisca il processo di trasformazione neoplastica in grado di originare un tumore vero e proprio. In tale modello, la trasformazione neoplastica non sarebbe assimilabile ad un “processo del tutto o nulla”, quanto ad un lento processo sostenuto da una serie di mutazioni e dalla progressiva perdita dei normali processi differenziativi.

Nel tentativo di riassumere, fin dalla fine degli anni ‘80 fu proposto il concetto che una neoplasia origina come malattia genetica. Successivamente, si è compreso che oltre all’integrità genomica mostra un importante ruolo l’insieme delle modificazioni epigenetiche, tanto che oggi si assume come ogni tumore debba insorgere con almeno 4-7 mutazioni, siano esse di natura genetica o epigenetica. Nel vasto scenario dell’immenso edificio biochimico di una cellula va inoltre considerato che esistono geni oncogeni, che favoriscono la crescita, geni oncosoppressori, che inibiscono la crescita, e geni regolatori, quali p53, caspasi, ecc.

Sebbene il paradigma delle lesioni genetiche multiple risulti valido nelle proprie linee generali, esso è tuttavia insufficiente a spiegare e razionalizzare vari fenomeni. Ad esempio, è stato osservato come molti neonati nascano con cloni di leucemia linfoblastica e traslocazione cromosomiale, senza tuttavia sviluppare la malattia conclamata. La frequenza di detto riscontro è circa 100 volte maggiore della frequenza della malattia nella popolazione normale. Per questa e per molte altre ragioni è sicuramente ammissibile che, talvolta, un clone neoplastico possa essere presente fin dalla nascita senza mostrare alcune segno della propria presenza. In definitiva, ogni individuo ha una notevole probabilità di ospitare un clone neoplastico, probabilità che nel corso della vita è quasi certezza.

A complicare questo vasto ed articolato scenario è la considerazione che numerose neoplasie sono rette e rinnovate da popolazioni di cellule staminali. Nel 1937, Jacob Furth e Morton Kahn evidenziarono che una singola cellula leucemica trapiantata in un topo riproduceva in tutto e per tutto la malattia. Ciò portò alla conclusione che un tumore si potesse così riprodurre e che le proprie cellule fossero, in un certo senso, tutte capaci di generare una neoplasia. Tuttavia, a partire dagli anni ‘60, Ernest McCulloch, James Till ed Andy Becker dimostrarono che cellule staminali del midollo rosso ematopoietico, e solo quelle, potevano rigenerare un midollo funzionante in topi irradiati. Da questi lavori arrivarono a postulare l’esistenza di cellule staminali neoplastiche: le cosiddette Cancer Stem Cells (CSC).

La prima definitiva prova della propria presenza, nonché la prima definizione della teoria staminale del cancro si deve a John Dick e colleghi nel 1994, i quali identificarono, in un caso di leucemia mieloide acuta, la prima linea di cellule staminali, riuscendo ad isolarla e purificarla. Queste cellule, e solo queste cellule, erano in grado di indurre una leucemia mieloide se trapiantate in topi nudi, mentre altre cellule non erano in grado di dare origine alla neoplasia.

Le CSC, come le altre cellule staminali, possono andare incontro a mitosi asimmetrica o ambivalente, e sono dotate della capacità di autorinnovamento e crescita illimitata. Che siano di natura neoplastica o di pertinenza fisiologica, le cellule staminali sono “costrette” in circostanze particolari:

--- vivono unicamente in nicchie di un tessuto, laddove è presente un adatto microambiente.

--- possiedono elevatissimi meccanismi di difesa contro i danni genetici: endonucleasi, ligasi, DNA polimerasi, ecc.

--- adottano preferenzialmente un metabolismo di tipo glicolitico (effetto Warburg).

--- si dividono poco e sono a lenta crescita: si può riflettere sul fatto che i farmaci citotossici siano in grado di agire con grande attività nei confronti di cellule in rapida divisione.

Secondo l’attuale modello della teoria staminale, non tutte le cellule di una massa tumorale sono identiche, ma vengono valutate in termini di “popolazione cellulare”, sorretta e sostenuta dal continuo rinnovamento di cellule staminali, le quali vivono all’interno di proprie nicchie nel cosiddetto bulk neoplastico, che è composto per la stragrande maggioranza da cellule tumorali “differenziate” appunto in senso tumorale. I principali farmaci citotossici (alchilanti, analoghi delle basi, ecc.) sono estremamente attivi nei confronti delle cellule tumorali, ma scarsamente attivi contro le CSC, le quali peraltro risultano ben schermate all’interno delle proprie nicchie. In questo modo la citoriduzione da chemioterapia potrebbe addirittura facilitare ulteriormente il processo di metastatizzazione.

 

Questo secondo modello è in contrapposizione con la già espressa teoria dell’espansione clonale, la quale prevede appunto che una qualsiasi cellula somatica, dopo l’accumulazione di ripetute mutazioni, traslocazioni cromosomiali e modifiche del pattern di metilazione, possa perdere i fisiologici meccanismi di apoptosi per divenire autorigenerante in sé.

Per comprendere alcuni aspetti e convergenze tra le due teorie è necessario presentare una rapida ma importante digressione sui radicali liberi dell’ossigeno.

Come è noto, un radicale libero è un atomo o una specie chimica con un elettrone spaiato nel proprio orbitale esterno. Durante la respirazione cellulare il glucosio è ossidato a CO2 con consumo di ossigeno O2, secondo la seguente equazione:

C6H12O6+ 6O2 → 6CO2 + 6H2O

Ovviamente, questa rappresenta l’equazione chimica netta, ed il risultato finale, che è indipendente dal cammino percorso ovvero dalle differenti e consequenziali reazioni biochimiche coinvolte (glicolisi, ciclo di Krebs, catena mitocondriale), è di fatto una semplice combustione, nella quale solo una parte dell’energia in gioco è dispersa come calore, mentre la gran parte è conservata in legami fosfoanidridici ad alta energia.

Nella precedente reazione si esprime la perfetta riduzione dell’ossigeno, il quale acquista 4 elettroni:

O2 + 4e- + 4H+ → H2O

Se invece l’ossigeno accetta un solo elettrone si viene a formare l’anione superossido:

O2 + 1e- → O2-

Se ne riceve 2 si forma perossido di idrogeno (acqua ossigenata):

O2 + 2e- + 2H+ → H2O2

Questa molecola non è un radicale in senso proprio ma può generare radicali liberi con estrema facilità.

Se l’ossigeno accetta 3 elettroni si formano lo ione idrossido ed il radicale idrossile:

O2 + 3e- + 2H+ → OH- + OH.

Il radicale idrossile è una delle specie radicaliche maggiormente pericolose in quanto altamente reattiva. All’incirca l’1-2% dell’ossigeno utilizzato a livello mitocondriale non subisce la completa riduzione ad acqua, ma dà origine ad anioni superossido per riduzione monovalente. A propria volta il superossido prodotto può seguire differenti percorsi:

--- la dismutazione, fino a formare acqua ossigenata:

O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2

--- la reazione di Haber-Weiss:

H2O2 + O2- → O2 + OH- + OH.

Le cellule hanno sviluppato potenti meccanismi di difesa contro il cosiddetto stress ossidativo, riuscendo così a contrastare le specie reattive dell’ossigeno che si formano con altissima frequenza. Tra questi è opportuno ricordare l’intervento di due enzimi: la superossidodismutasi (SOD) e la catalasi (CAT).

La SOD è un enzima sia citosolico che mitocondriale: ne esistono due isoforme, una che utilizza come cofattore il rame (CuSOD) e l’altra il manganese (MnSOD). Questo enzima catalizza la dismutazione del superossido ad acqua ossigenata, come già accennato sopra:

O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2

La SOD accelera la spontanea dismutazione del superossido ad acqua ossigenata, impedendo all’anione superossido di reagire con acqua ossigenata secondo la reazione di Haber-Weiss. L’ossigeno molecolare derivato dall’azione enzimatica della SOD è particolarmente stabile, in quanto si tratta di ossigeno tripletto, una forma particolarmente stabile dell’ossigeno.

La CAT favorisce la dismutazione dell’acqua ossigenata in acqua ed ossigeno secondo la seguente reazione:

2H2O2 → O2 + 2H2O

In definitiva, la CAT possiede la funzione di primaria importanza di impedire lo svolgersi della reazione di Haber-Weiss, mantenendo così, entro limiti accettabili, il livello di stress ossidativo.

Nel vasto complesso dei meccanismi di difesa contro lo stress ossidativo giocano un ruolo essenziale anche il glutatione e gli enzimi ad esso associati, nonché la via metabolica dei pentoso fosfati.

Dopo questa digressione a proposito dei meccanismi di gestione dello stress ossidativo è possibile riconsiderare la teoria staminale del cancro. Come già detto, le CSC sono cellule che vivono in strette nicchie in condizione di anaerobiosi, utilizzando principalmente la glicolisi anaerobia o aereobia, ovvero l’effetto Warburg indipendentemente dalla pO2.

Le CSC presentano complessi meccanismi di controllo genico e di regolazione dell’integrità genomica, ma risultano particolarmente sensibili allo stress ossidativo ed allo stress genotossico. In termini generali, glicolisi significa netta riduzione del consumo di ossigeno e conseguentemente riduzione della formazione di radicali liberi. D’altro canto, è noto fin dai lavori di Oparin che la vita si è evoluta in anaerobiosi, in cui la glicolisi rappresenta il primo meccanismo di trasformazione energetica. Va inoltre sottolineato che oltre a manifestare indubbie ricadute sullo stress ossidativo, la glicolisi comporta evidenti vantaggi, in quanto in grado di generare vari prodotti come il lattato, il piruvato, ecc., i quali possiedono importanti significati anfibolici ed anaplerotici.

 

Altre numerose evidenze hanno dimostrato la presenza delle cellule staminali tumorali in numerose neoplasie umane. In particolare, nel melanoma è presente una netta prevalenza delle CSC, così come nel cancro al seno ed al polmone, nei tumori del sistema immuno-ematopoietico ed in molte altre neoplasie. Sono state individuate numerose cellule che esprimono antigeni specifici nelle cellule staminali ed in xerotrapianti in topi nudi hanno dimostrato di poter indurre la medesima neoplasia. È stato inoltre ampiamente espresso come nel bulk neoplastico, oltre alle CSC, siano spesso presenti popolazioni eterogenee di cellule in via di differenziazione: si tratta ovviamente di una differenziazione aberrante in senso neoplastico.

Riassumiamo i concetti fondamentali ed il principale punto di diversità fra la teoria clonale e quella staminale del cancro: secondo la teoria clonale un tumore nasce come frutto dell’accumulo di svariate mutazioni, oggi stimate in almeno 15 per la trasformazione neoplastica, ed almeno 80 in una neoplasia avanzata. Il cancro originerebbe a carico delle cellule diploidi somatiche, e dette alterazioni geniche potrebbero essere mutazioni, delezioni o alterazioni epigenetiche. Ogni cellula tumorale rappresenta un clone unico e ripetitivo di se stesso. Secondo la teoria staminale un tumore è originato, retto e sostenuto da popolazioni di cellule staminali con capacità autorinnovante. A sostegno di questa teoria, vi è l’identificazione di specifici marker delle cellule staminali (aldolasi, CD44, ecc.) e la propria capacità di originare neoplasie in xerotrapianti in topi nudi. Numerose vie di segnalazione sono state identificate nel dimostrare un ruolo essenziale, tra cui le vie di segnalazione di Notch, Shh, Wnt. In particolare, la Notch signaling pathway è associata alla neurogenesi ed alla formazione del pancreas durante l’embriogenesi, mentre nell’adulto è strettamente collegata alla regolazione del comparto staminale delle cellule ematopoietiche e del tratto gastro-intestinale, ed un suo segnale aberrante è associato a livello delle cellule staminali del cancro al seno, di quelle del polmone, delle emopatie, ecc.

 

Nelle cellule neoplastiche è presente quella gigantesca alterazione metabolica che complessivamente viene denominata effetto Warburg. Secondo lo stesso Warburg la patologia oncologica nasce come un primario difetto della respirazione, ovvero dalla mancanza della fosforilazione ossidativa: questa ipotesi presenta numerose prove al proprio sostegno, seppur anche alcune incongruenze. La comune caratteristica intrinseca a tutte le cellule neoplastiche è la profonda alterazione del metabolismo energetico. Negli ultimi anni, le conseguenze dell’effetto Warburg sono state oggetto di approfonditi studi. Da questi intensi programmi di ricerca è emerso che:

--- la stragrande maggioranza delle neoplasie, siano esse carcinomi o sarcomi, utilizzano prevalentemente un metabolismo di tipo glicolitico aerobio, ovvero presentano una forte attività glicolitica indipendentemente dalla pO2.

--- il suddetto fenomeno fu inizialmente posto in relazione ad una minore ossigenazione locale, causata dalla mancanza di un'adeguata rete vascolare. Sebbene la ridotta vascolarizzazione e la limitata ossigenazione possano contribuire alle alterazioni metaboliche descritte, queste si mostrano come un fattore minoritario e non causale. Nella genesi dello switch glicolitico è stato inoltre proposto che durante la glicolisi si producono una serie di metaboliti intermedi utili alla promozione della crescita cellulare.

--- l’alta affinità per il glucosio e la prevalenza della glicolisi aerobia sono altresì documentate, oltre che da studi in vitro ed in vivo, anche dalle moderne tecniche di imaging: è sulla base di questi cambiamenti metabolici che si fonda l’utilizzo della FDG-PET. Da questa tecnica è stato chiaramente evidenziato in vivo, su pazienti affetti da neoplasia, la stretta dipendenza della stessa dall’effetto Warburg. Detto fenomeno, oltre ad essere presente nella sede primaria, è anche di capitale importanza nella valutazione del processo di metastatizzazione neoplastica.

--- l’aumento della glicolisi aerobia nelle cellule tumorali è altresì associato ad up-regulation di tutti gli enzimi glicolitici: più precisamente si mostra un cambiamento nei principali isoenzimi espressi, tra cui i più importanti, ai fini dell’effetto Warburg sono l’esochinasi (HK), la piruvato chinasi (PK) e la lattato deidrogenasi (LDH).

-    HK: questo enzima è il primo delle 10 reazioni della via glicolitica, o via di Embden-Meyerhof-Parnas, e catalizza la fosforilazione del glucosio in posizione 6. Dell’HK esistono vari isoenzimi: in particolare ne sono state caratterizzate 4 isoforme. La I è ubiquitaria e presente in tutte le cellule. La IV, detta anche glucochinasi, è espressa a livello epatico e presenta peculiari caratteristiche: bassa Km ed insensibilità al feedback negativo esercitato dal substrato. È questa isoforma una delle più importanti nella regolazione dell’omeostasi glicemica, mentre le isoforme II e III, così come la I, presentano bassa Km ed alta affinità. Mentre la III è inibita da un eccesso di substrato, la II ne è insensibile. In particolare, l’isoforma II è espressa nel muscolo scheletrico e nelle cellule tumorali, dove gioca un ruolo di primaria importanza. Propriamente, la stragrande maggioranza delle cellule neoplastiche esprime alti livelli di esochinasi II. Quest’ultima è la maggiore responsabile dell’effetto Warburg e mostra una struttura ben differente dagli altri isoenzimi dell’HK. È inoltre significativo notare che l’esochinasi II espressa in cellule tumorali potrebbe perdere parzialmente l’inibizione da glucosio-6-fosfato e da ATP, e recentemente è stata dimostrata la traslocazione nucleare dell’esochinasi II in cellule tumorali di cervice uterina, suggerendo il proprio coinvolgimento nei meccanismi di regolazione dell’espressione genica.

-    PK: è l’enzima che catalizza il trasferimento di un gruppo fosforico dal fosfoenolpiruvato all’ADP ed è l’enzima finale della via glicolitica. Assieme all’HK è uno dei più importanti regolatori di tale pathway metabolico. Nell’uomo sono state isolate 4 isoforme (M1, M2, L e R): mentre la L e la R sono prevalentemente espresse nel fegato, la M1 è ubiquitaria e la M2 è espressa in cellule embrionali. L’isoforma M2 è espressa anche nella maggioranza dei tumori umani a basso indice proliferativo. La riduzione dell’espressione della PK induce un sensibile aumento della fosforilazione ossidativa. La sostituzione del gene della PK II con la PK I riduce sensibilmente la proliferazione cellulare di varie linee tumorali umane. L’iniezione in topi nudi di cellule tumorali down-regolate per la PKM2 mostra una notevole riduzione nello sviluppo di tumori: detto dato è stato inoltre confermato mediante l’inoculazione di una miscela di cellule tumorali PKM2:PKM1 (50:50).

-    LDH: questo enzima catalizza la riduzione del piruvato trasformandolo in lattato, consentendo l’ossidazione del NADH a NAD+, permettendo così il prosieguo del processo glicolitico. Come l’HK e la PK, anche l’LDH è un enzima importante nella genesi dell’effetto Warburg e delle sue conseguenze fisiopatologiche. Nell’uomo esistono 5 isoforme dell’LDH (1-5), caratterizzate da differenti valori di Km. Nella maggioranza dei tumori umani è fortemente espressa la LDH-5, tipica del muscolo scheletrico, con bassa Km ed alta affinità. L’over-espressione dell’LDH negli ammalati neoplastici è talmente evidente da essere spesso correlata con un aumento dell’LDH sierico. Il blocco dell’LDH-5 in cellule di tumori mammari umani riduce fortemente la chemioresistenza al taxolo. Il knockdown sperimentale dell’LDH-5 induce un notevole e rimarchevole arresto della proliferazione cellulare. In modelli murini di xenotrapianto tumorali è stato evidenziato che il blocco dell’LDH-5 potrebbe rappresentare una promettente terapia per la leiomiomatosi ereditaria ed il cancro del rene a cellule chiare.

Dai profondi cambiamenti metabolici sopra descritti deriva una forte produzione di acido lattico ed un’acidificazione della matrice extracellulare intorno alla neoplasia. L’acido lattico prodotto, e conseguentemente l’abbassamento del pH, favorisce la neoangiogenesi mediante la stimolazione del fattore HIF-1 da parte delle cellule endoteliali, la degradazione del tessuto connettivo, il blocco della chemiotassi delle cellule T e l’attivazione di metalloproteasi. A propria volta il fattore HIF-1 up-regola l’espressione degli enzimi glicolitici e del trasportatore degli zuccheri GLUT1-GLUT3.

Nelle cellule tumorali è presente un ulteriore importante meccanismo metabolico alterato a valle della glicolisi: il ciclo di Krebs o ciclo degli acidi tricarbossilici. In relazione a questa alterazione gioca un ruolo di primaria importanza il citrato: molte cellule neoplastiche esprimono livelli insolitamente bassi di questa molecola. Vari studi hanno documentato che la gran parte del citrato è trasportato attraverso i mitocondri mediante lo specifico shuttle del citrato e sotto l’azione della citrato-liasi scisso in ossalacetato ed acido acetico. Quest’ultimo può essere utilizzato per la sintesi degli acidi grassi, tra cui acidi grassi a catena medio-corta, i quali a propria volta influenzano il livello di acetilazione degli istoni, tanto che in varie forme tumorali si mostra una overespressione dell’ATP citrato liasi (ACL). In cellule epiteliali di carcinoma ovarico l’inibizione dell’ACL promuove una pronta risposta apoptotica ed il knockdown dell’ACL induce in topi nudi l’arresto della crescita e dello sviluppo di tumori polmonari non a piccole cellule.

Come già accennato, le notevoli alterazioni metaboliche descritte appaiono di comune riscontro nella quasi totalità delle neoplasie umane. Dai dati riportati è possibile affermare che questo peculiare stato metabolico delle cellule tumorali costituisce senza dubbio alcuno una caratteristica tipica e specifica delle cellule neoplastiche stesse.

Le terapie attualmente in uso sono volte a colpire gli acidi nucleici (alchilanti, analoghi delle basi, radioterapia), o i microtubuli del fuso mitotico (alcaloidi della pervinca), tuttavia, come è drammaticamente noto, l’intervento sui suddetti target non presenta sufficiente selettività e l’indice terapeutico di detti farmaci è estremamente basso, con ovvie ricadute sulla qualità della vita e la morbilità dei malati di cancro. Similmente, anche gli effetti a lungo termine sulla sopravvivenza mostrano evidenti limiti.

Mentre ancora oggi poco è stato compiuto a proposito dello sviluppo chimico-farmaceutico di farmaci in grado di colpire il target metabolico, l’importanza di questa strategia è sottolineata da numerose evidenze sperimentali. L’inibizione della glicolisi nelle cellule cancerose ha dimostrato di indurre un forte innesco dell’apoptosi ed una notevole riduzione della vitalità cellulare. Tale blocco farmacologico appare in grado di ripristinare l’espressione e l’attività della p53.

Se si considera che molteplici fattori sono situati a monte dell’effetto Warburg (ad esempio c-Myc, p53, HIF-1α, modificazioni epigenetiche, interazioni con cellule stromali, ecc.) appare ancor più sensato e ragionevole ritenere di poter colpire a valle tale fenomeno, in quanto è impossibile intervenire selettivamente su tutti i suddetti bersagli.

A ciò si deve aggiungere che in numerose linee cellulari, durante la cancerogenesi si mostra un aumento notevole della glicolisi ed una netta diminuzione della respirazione. Un fattore chiamato in gioco è la presenza di proteine disaccoppianti simili a quelle del grasso bruno, ovvero le proteine della famiglia UCP. Una delle critiche più capziose che furono rivolte a Warburg riguarda il fatto che spesso il consumo di ossigeno in molte cellule tumorali non risulta alterato. In ogni caso, la risultante è la stessa in quanto si presenta una netta diminuzione della fosforilazione ossidativa. Questo ha portato allo sviluppo della teoria di Feodor Lynen, peraltro accettata dallo stesso Warburg, quale possibile ipotesi alternativa, secondo la quale più che la mancanza di fosforilazione ossidativa, in queste cellule è mancante la capacità di sintesi di ATP. Sarebbe perciò presente un disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa.

Recentemente è stato dimostrato che cellule di leucemia mieloide, coltivate su cellule staminali mesenchimali di midollo osseo, presentano un'ulteriore riduzione della produzione di ATP ed un aumento netto della glicolisi, senza una vera diminuzione del consumo di ossigeno. Ciò viene imputato ad una overespressione della proteina disaccoppiante UCP-2, la quale oltre a manifestare effetti del tutto simili al 2,4-dinitrofenolo, conferisce fortissima chemioresistenza ed inibizione dell’apoptosi. La soppressione dell’espressione di detta proteina non inibisce il fenomeno ma evidenzia un proprio ruolo nella perdita del potenziale di membrana della membrana mitocondriale interna.

Dimostrato che le cellule tumorali, così come quelle staminali, vivono preferenzialmente di glicolisi non in funzione della pO2, ma relativa ad un difetto intrinseco della membrana mitocondriale e ad un utilizzo preferenziale di altre vie metaboliche, cosa può influire sulla membrana mitocondriale?

Un plausibile tentativo di rispondere a questo interrogativo viene da un semplice quanto interessante dato: in tutte le neoplasie si mostra una fortissima alterazione nei canali del potassio, i quali risultano overespressi ed iperfunzionanti. La differenza di potenziale a livello della membrana mitocondriale è estremamente elevato, molto maggiore di quella di qualsiasi altra membrana cellulare, con l’interno a -180 mV. In particolare, le cellule tumorali esprimono elevati livelli nel numero di canali del K+, sia di tipo rettificante entrante che in uscita. D’altro canto, un gruppo di canali della membrana mitocondriale è altamente espresso nei tumori umani ed è fortemente associato al blocco dell’apoptosi ed alla riprogrammazione in senso “pro-survival”: si tratta dei canali Kv1.3.

 

Questi canali ionici sono altamente espressi ed attivi nella quasi totalità dei tumori, e realizzano un meccanismo precipuo di iperpolarizzazione. In relazione ai canali Kv1.3 è possibile affermare che:

--- la loro attività è sensibile al pH ed all’ATP.

--- la stragrande maggioranza delle cellule tumorali presenta canali del potassio del tutto simili, in attivazione perenne (canali tipo hEAG, hIK1, KCa1.1, HERG e Kv1.1) con correnti a cinetica variabile IKr (rapida), IKs (lenta), IKv (costitutiva). Questi canali, attraverso meccanismi complessi, contribuiscono a stabilizzare la membrana cellulare esterna, controllando anche i vari sbalzi di osmolarità, altamente frequenti nelle cellule tumorali, dovuti all’inefficienza della pompa Na+/K+ATPasi.

--- il tutto appare gravato inoltre dal basso pH extramitocondriale: si consideri che la membrana mitocondriale esterna è liberamente permeabile.

--- esperimenti sull’epilessia nel gatto confermano una stretta relazione tra ossidazione del NADH mitocondriale e depressione delle correnti nette del potassio in fettine di cervello isolato.

--- tutto ciò non è solo la risultante di lesioni geniche e/o epigenetiche, le quali comportano un'overespressione dei canali, ma è favorito appunto dallo stato di glicolisi aerobia che in sé contribuisce a mantenere una differenza di potenziale mitocondriale ridotta, mediante la riduzione dei livelli di ATP, la perdita dell’omeostasi ionica ed il basso pH.

--- in ricerche condotte degli anni ‘60-‘70 furono segnalate strette relazioni tra concentrazione del potassio intra- ed extra-mitocondriale e velocità del consumo di ossigeno. In particolare la fuoriuscita di K+ dai mitocondri è associata ad un abbassamento della fosforilazione ossidativa e del consumo di O2, e viceversa. I mitocondri presentano a carico della membrana interna un potenziale ∆ψ = -180 mV, il quale genera un forte richiamo di ioni potassio, carichi positivamente. In condizioni normali la concentrazione intracellulare di K+ è approssimativamente di 100 mM, mentre nei mitocondri è di 150-180 mM. In condizioni di stress la concentrazione di K+ extracellulare, che normalmente è dell’ordine di 3 mM, può aumentare fino a 10 mM. È stato documentato come i mitocondri possano operare quali depositi del potassio: in molte cellule l'associazione dei mitocondri stessi alla membrana cellulare nonché la presenza della connessina 43 promuovono tale funzione.

 

Dei metalli alcalini, solo il potassio è stato dimostrato agire quale cofattore stechiometrico, in particolare nella piruvato chinasi: il proprio ruolo consiste nell’orientare il piruvato nel sito attivo legandosi a ponte tra l’enzima ed il substrato. Lo ione K+ può inoltre interagire con l’ossigeno dei gruppi fosfato delle catene di nucleotidi e con gli ossigeni esterni delle basi puriniche e pirimidiniche. Per le proprie dimensioni può attorniarsi fino ad un massimo di 8 atomi di ossigeno situati ai vertici di un cubo.

Tralasciando le implicazioni sull’attività e le implicazioni dell’equazione di Debye-Hückel, è opportuno ricordare come le alterazioni dell’omeostasi del potassio, in parte dovute ad un’inefficienza della pompa Na+/K+ATPasi, portino a gravi implicazioni anche sulle strutture telomeriche, le quali sono sequenze di DNA che si osservano agli estremi dei cromosomi, e che sono essenziali per la loro stabilità. In questi segmenti di DNA telomerico è stata identificata la presenza di DNA a filamento quadruplo che presenta un appaiamento di basi noto con il nome di quartetto di guanina. Essi si distribuiscono in piani paralleli ed orientano gli ossigeni dei gruppi carbonilici in modo tale che ogni due piani di quartetti di guanina si colloca uno ione K+. La presenza del catione compensa la forza repulsiva fra gli ossigeni e contribuisce alla stabilizzazione di un assemblaggio strutturale che in sua assenza sarebbe assolutamente precario. Questa funzione non può essere svolta dallo ione Na+ a causa delle dimensioni più piccole rispetto alla cavità delimitata dagli ossigeni esterni delle 8 guanine. Analogamente, è stato provato che lo ione idratato [K(H2O)6]+ contribuisce alla stabilizzazione degli acidi nucleici (DNA e RNA), minimizzando la repulsione risultante dalla carica negativa dei gruppi fosfato che sono orientati verso l’esterno nella catena dei nucleotidi. Si può quindi concludere che dette alterazioni nella regolazione dell’attività elettrofisologica dello ione K+ possono contribuire ad una maggiore instabilità genica.

È interessante analizzare un'altra non meno essenziale conseguenza derivata dai bassi livelli intracellulari di ATP dovuti allo stato di glicolisi aerobia.

 

La molecola dell'ATP presenta due legami fosfoanidridici, definiti ad alta energia. Da questa asserzione universalmente accettata, nonostante possa risultare in parte discutibile, si può sinteticamente affermare che l’idrolisi di una fosfoanidride libera una notevole quantità di energia, in quanto il legame P-O-P-O presenta varie cariche negative vicine, presentando una minore stabilizzazione per risonanza.



Nel caso dell’idrolisi dell’ATP in un sistema biologico vale la seguente relazione:

 

ΔG0 rappresenta la misura del valore di energia di idrolisi standard quando tutti i reagenti sono alla concentrazione 1 M, a pH = 7, alla pressione di 1 atmosfera, ed alla temperatura di 298°K. L’energia libera di una reazione rappresenta in definitiva l’energia effettivamente utile ed utilizzabile al fine di compiere lavoro, sia esso il lavoro svolto da un enzima o da un canale ionico. Un sistema biologico con ΔG = 0 corrisponde al raggiungimento di uno stato di equilibrio con costante di equilibrio kq = 1: ciò comporta entropia massima e la morte del sistema.

Si consideri cosa accade se le concentrazioni di ATP diminuiscono e conseguentemente quelle di ADP e Pi salgono. I valori sopra riportati sono valori medi generali comuni a quasi tutte le cellule, soggetti a variazioni piuttosto ristrette.

 

 

Sulle ordinate sono riportati i valori del ΔG di idrolisi, cioè i valori dell’energia utile a compiere lavoro, mentre sulle ascisse sono riportati i valori percentuali della diminuzione di ATP. È calcolato un calo compreso fra lo 0 e l’80% rispetto ai valori assunti come fisiologici. Per rendersi conto della non casualità di questi numeri e della loro notevole sottostima si analizzi un ulteriore interessante dato: le cellule staminali esprimono un metabolismo prettamente glicolitico, in particolare le staminali per eccellenza, ovvero le pluripotenti umane (IPSCs). Come si può notare, in questo caso le differenze dei livelli di ATP si mostrano notevolmente maggiori rispetto alla controparte somatica differenziata (H7TF). Inutile esprimere stante così le cose l’importanza che ne deriva sul ΔG di idrolisi.